21 Mart 1522 tarihinde İstanbul‘da Topkapı Sarayı’nda doğdu. Kanuni Sultan Süleyman ve Hürrem Sultan’ın tek kızıdır. Mihrimah Sultan’ın doğumundan 2 yıl sonra da Hürrem Sultan, Kanuni Sultan Süleyman’ın ölümünden sonra yerine geçecek olan diğer çocuğu II. Selim’i dünyaya getirdi. Kanuni Sultan Süleyman Mihrimah Sultan’ı çok sever, bütün isteklerini yerine getirirdi. Mihrimah Sultan çok iyi yetişti ve iyi bir eğitim gördü.

1539 yılında 17 yaşındayken Mimar Sinan ve Diyarbakır valisi Rüstem Paşadan evlenme teklifi aldı. Rüstem Paşa‘yla (Topal Rüstem) evlendi. Düğün töreni iki küçük erkek kardeşi Bayezid ve Cihangir’in sünnet düğünüyle birlikte At Meydanı’nda (bugünkü Sultanahmet Meydanı) büyük şölenlerle kutlandı.

Rüstem Paşa bu evlilikten sonra sadrazam oldu ve 1544-1561 yılları arasında 2 yıllık bir süre hariç kesintisiz sadrazamlık yaptı. Mihrimah Sultan yaşamı boyunca devlet işlerinde çok söz sahibi oldu. Babasını Malta’ya sefer düzenlemeye ikna etmek için kendi parasıyla 400 gemi yaptıracağına söz verdiği bile söylenir.

Annesi Hürrem Sultan gibi Lehistan kralı II. Zygmunt’la yazışmalar yaptı. Çok büyük bir servet sahibi oldu. 1540-1548 yılları arasında Mimar Sinan İstanbul’un Üsküdar ilçesinde cami Üsküdar İskele Camii, medrese, ilkokul ve hastaneden oluşan büyük bir külliye yaptı.

Ayrıca 1562-1565 yılları arasında gene Mimar Sinan, İstanbul’un Edirnekapı semtinde cami, çeşme, hamam ve medreseden oluşan Mihrimah Sultan Camii ve külliyesini yaptı. Mihrimah güneş ve ay demektir. Caminin iki minaresinin arasından ay doğarken, yanındaki caminin iki minaresi arasından da güneş doğar. Mimar Sinan’ın camiyi yaparken bunu bilinçli olarak tasarladığı öne sürülmüştür.

Annesi 1558 yılında öldükten sonra babasına annesinin oynadığı danışmanlık rolünü oynadı. 1566 yılında babası öldükten sonra yerine geçen erkek kardeşi Sultan II. Selim’in saltanatı boyunca da danışmanlığını sürdürdü. Anneleri Hürrem Sultan ölmüş olduğu için kardeşi için adeta bir Valide Sultan rolünü oynadı.

Ayşe Hümaşah Sultan, Murad Bey, Mehmed Bey isminde 3 çocuğu oldu.

25 Ocak 1578 tarihinde İstanbul’da vefat etti.

2011 yapımlı Muhteşem Yüzyıl Türk televizyon dizisinde Pelin Karahan tarafından canlandırılırken, 2003 yılında yapımı gerçekleştirilen Hürrem Sultan adlı televizyon dizisinde Özlem Çınar tarafından canlandırıldı.